本大纲对应于2007版专业人才培养方案

实验课程号：30947B1sy

1. 课程属性：必修

2. 实验属性：非独立设课

3. 学时学分：总学时40  总学分2.0   实验学时20

4. 实验应开学期：秋季

5. 先修课程：有机化学、分析化学、动物生理、动物生化和动物营养

一 课程的性质与任务

本实验课是动物毒物学的重要组成部分，有助于学生把理论知识应用于实践，有助于学生能力的培养。通过动物毒物学实验课的学习，使学生掌握饲料中有毒有害物质的测定方法，为生产服务。

二 实验的目的与基本要求

通过学习，掌握常见动物毒物的检测方法。

三 实验考核方法及办法

考查：采用考勤、实验操作和实验报告记分相结合的考核方式。

四 实验项目一览表

表1  实验内容一览表

序号	实验名称	实验类型	实验要求	面向专业	学时
实验一	饲料中霉菌的测定	综合性	必修	检疫、检疫教	6
实验二	大豆及大豆制品中尿素酶活性的检测	验证性	必修	检疫、检疫教	2
试验三	饲料中亚硝酸盐含量的测定	验证性	必修	检疫、检疫教	4
实验四	饲料中铬的测定	验证性	必修	检疫、检疫教	4

实验一 饲料中霉菌检验方法

（一）实验的目的和要求

学会饲料中霉菌的测定方法。

（二）实验内容或原理

根据霉菌生理特性，选择适宜于霉菌生长而不适宜于细菌生长的培养基，采用平皿计数方法，测定霉菌数。3、需用的试剂等。

（三）设备及材料

天平：感冒1g，最大秤量1000g；显微镜：1500×；温箱：25~28±1℃；冰箱：普通冰箱；高压灭菌器：2.5kg；干燥箱：50~250±1℃；水浴锅：45~77±1℃；振荡器：往复式；微型混合器：2900r/min；电炉；酒精灯；接种棒：镍铬丝；温度计：100+1℃；载玻片；盖玻片；乳钵；试管架；玻璃三角瓶：250，500mL；试管：15×150mm；平皿：直径9cm；吸管：1，10mL；玻珠：直径5mm；广口瓶：100，500mL；金属勺、刀等；橡皮乳头。

（四）实验步骤

霉菌检验程序如下：

（五）教学方法

讲解、示范和巡回指导。

（六）考核要求

掌握饲料中霉菌测定的原理及方法

（七）实验报告要求

实验原理、实验步骤、实验结果分析

实验二  大豆及大豆制品中尿素酶活性的检测

（一）实验的目的和要求

掌握大豆制得的产品和副产品中尿素酶活性的测定。本法可确认大豆制品的湿热处理程度。

（二）实验内容或原理

将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液混合，在30℃保持30min，尿素酶催化尿素水解产生氨的反应。用过量盐酸中和所产生的氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴。

（三）实验设备

1.仪器:

样品筛:孔径200μm；

酸度计:精度0.02pH,附有磁力搅拌器和滴定装置；

恒温水浴:可控温30±0.5℃；

试管:直径18mm,长150mm,有磨口塞子；

精密计时器；

粉碎机:粉碎时应不生强热(例如球磨机)；

分析天平:感量0.1mg；

移液管：10mL。

2.试剂和溶液 

尿素(GB696─77)：分析纯；

磷酸氢二钠(GB 1263─77):分析纯；

磷酸二氢钾(GB 1274─77):分析纯；

尿素缓冲溶液(pH6.9至7.0):4.45g磷酸氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于水并稀释至1000mL,再将30g尿素(5.1)溶在此缓冲溶液中,可保存1个月。

盐酸(GB 622─77):分析纯,0.1M溶液；

氢氧化钠(GB 629─77):分析纯,0.1M标准溶液,按GB 601标准溶液制备方法的规定配制。

（四）实验步骤

1．称取约0.2g已粉碎的试样,称准至0.1mg,转入试管(3.4)中(如活性很高只称0.05g试样),移入10mL尿素缓冲溶液(4.4),立即盖好试管并剧烈摇动,马上置于30±0.5℃恒温水浴(3.3)中,准确计时保持30min。即刻移入10mL盐酸溶液(4.5),迅速冷却到20℃。将试管内容物全部转入烧杯,用5mL水冲洗试管两次,立即用氢氧化钠标准溶液(4.3)滴定至pH4.70。

2．另取试管作空白试验,移入10mL尿素缓冲液(4.4),10mL盐酸溶液(4.5)。称取与上述试样量相当的试样,也称准至0.1mg,迅速加入此试管中。立即盖好试管并剧烈摇动。将试管置于30±0.5℃的恒温水浴,同样准确保持30min,冷却至20℃,将试管内容物全部转入烧杯,用5mL水冲洗试管两次,并用氢氧化钠标准溶液(4.3)滴定至pH4.70。

3．计算

以每分钟每克大豆制品释放氮的毫克量表示的尿素酶活性U,按下式计算:

式中:C——氢氧化钠标准溶液摩尔浓度,mol/L；

V0——空白试验消耗氢氧化钠溶液体积,mL；

V——测定试样消耗氢氧化钠溶液的体积,mL；

m——试样质量,g。

注:若试样经粉碎前的预干燥处理时,则

式中:S——预干燥时试样失重的百分率。

4．重复性

同一分析人员用相同方法,同时或连续两次测定结果之差不超过平均值的10％，以其算术平均值报告结果。

（五）教学方法

讲解、示范和巡回指导。

（六）考核要求

测定大豆制品脲酶活性的操作方法正确，并掌握结果计算方法，两平行样测定值的误差在允许范围内。

（七）实验报告要求

实验原理、实验步骤、实验结果分析。

实验三 饲料中亚硝酸盐的测定

（一）实验目的

学习和掌握饲料中亚硝酸盐的测定方法。

（二）实验原理

样品在微碱性条件下除去蛋白质，在酸性条件下试样中的亚硝酸盐与对氨基苯磺酸反应，生成重氮化合物，再与N-1-蔡乙二胺盐酸盐偶合形成红色物质，进行比色测定。

（三）仪器与试剂

1.仪器

分光光度计，比色管等。

2.试剂

本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。

四硼酸钠饱和溶液：称取25 g四硼酸钠(Na2B4O7•l0H2O，GB632)，溶于500 mL温水中，冷却后备用。

10.6%亚铁氰化钾溶液：称取53g亚铁氰化钾〔K4Fe(CN)6•3H2O，GB1273)，溶于水，加水稀释至500mL。

22%乙酸锌溶液:称取110g乙酸锌〔Zn(CH3COO)2•2H2O，HG3-1098)，溶于适量水和15mL冰乙酸(GB676)中，加水稀释至500mL。

0.5%对氨基苯磺酸溶液：称取0.5g对氨基苯磺酸(NH2C6H4SO3H•H2O，HG3-992)，溶于10%盐酸中，边加边搅，再加10%盐酸稀释至100mL，贮于暗棕色试剂瓶中，密闭保存，一周内有效。

0.1%N-1-奈乙二胺盐酸盐溶液：称取0.1gN-1-萘乙二胺盐酸(C10H7NHCH2NH2•2HCI)，用少量水研磨溶解，加水稀释至100mL，贮于暗棕色试剂瓶中密闭保存，一周内有效。

5mol/L盐酸溶液：量取445mL盐酸(GB622)，加水稀释至1000mI。

亚硝酸钠标准贮备液：称取经115士5℃烘至恒重的亚硝酸钠(GB633)0.3000g，用水溶解，移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于400ug亚硝酸根离子。

亚硝酸钠标准工作液：吸取5.00mL亚硝酸钠标准贮备液，置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于10ug亚硝酸根离子。

（四）操作步骤

1.试液制备

称取约5g试样，精确到0.001g，置于200mL烧杯中，加约70mL温水(60士5℃)和5ml四硼酸钠饱和溶液，在水浴上加热15min(85±50℃)，取出，稍凉，依次加入2mL10.6% 亚铁氰化钾溶液，2mL22%乙酸锌溶液，每一步须充分搅拌，将烧杯内溶液全部转移至200ml容量瓶)中，用水洗涤烧杯数次，并入容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，静置澄清，用滤纸过滤，滤液为试液备用。

2.标准曲线绘制

吸取0、0.25，0.50，1.00，2.00，3.00mL亚硝酸钠标准工作液，分别置于50mL棕色容量瓶中，加水约30mL，依次加入2mL0.5%对氨基苯磺酸溶液，2mL盐酸溶液，混匀，在闭光处放置3~5min，加入2mL0.1%N-1-蔡乙二胺盐酸盐溶液，加水稀释至刻度，混匀，在闭光处放置15min，以0mL亚硝酸钠标准工作液为参比，用10mm比色池，在波长538 nm处，用分光光度计(4-1)测其他各溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，各溶液中所含亚硝酸根离子质量为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。

3.测定

准确吸取试液约30m L,置于50mL棕色容量瓶(4-5)中，从“依次加入2ml，0.5%对氨基苯磺酸溶液(3.4),2 mL盐酸溶液”起，按标准曲线测定的方法显色和测量试液的吸光度。

4.结果计算

计算公式

式中：X—试样中亚硝酸盐(以亚硝酸钠计)含量，mg/kg；

V—试样测定时吸取试液的体积，mL；

m1-VmL试液中所含亚硝酸根离子质量，ug(由标准曲线读得或由回归方程求出)；

m—试样质量，g；

1.5—亚硝酸钠质量和亚硝酸根离子质量的比值。

5.结果表示 

每个试样取2个平行样进行测定，以其算术平均值为结果，表示到1mg/kg。

6.重复性

同一分析者对同一试样同时或快速连续地进行两次测定，所得结果之间的差值；

在亚硝酸盐含量小于或等于1mg/kg时，不得超过平均值的50%；

在亚硝酸盐含量大于1mg/kg时，不得超过平均值的20%。

（五）教学方式

讲解、示范和巡回指导。

（六）考核要求

掌握饲料中亚硝酸钠的测定方法。

（七）实验报告

测定步骤与实验测定结果。

实验四  饲料中铬的测定方法

（一）实验的目的和要求

学会饲料中铬的测定方法。

（二）实验内容或原理

以干灰化法分解样品，在碱性条件下用高锰酸钾将灰分溶液中铬离子氧化为六价铬离子，再将溶液调至酸性，使六价铬离子与二苯卡巴肼生成玫瑰红色铬合物，进行比色测定，求得铬的含量。

（三）实验设备

分析天平。

高温电炉（马福炉）。

实验用样品粉碎机或研钵。

电炉：600W。

容量瓶：50、100、1000mL。

吸量管：1、5、10mL。

移液管：5、10、15、20、25、30mL。

三角烧瓶：150mL。

短颈漏斗：直径6cm。

瓷坩埚：60mL。

滤纸：11cm，定性，快速。

分光光度计：有10mm比色皿，可在540nm处测量吸光度。

（四）实验步骤

1.试样处理

称取1.0~1.5g样品，精确到0.001g，置于60mL瓷坩埚中，在电炉上炭化完全后，置于马福炉内，由室温开始，徐徐升温，至600℃灼烧5h，直至样品呈白色或灰白色无碳粒为止。

取出冷却，加入5mL0.5mol/L硫酸溶液，在电炉上微沸，内容物全部移入150mL三角瓶中，并用热水反复洗涤坩埚3~4次，洗涤液并入三角瓶中，加入1.5mL4mol/L氢氧化钠溶液，再加入2滴2%高锰酸钾溶液，加水使瓶内溶液总体积为60~70mL，摇匀，溶液呈紫红色，在电炉上加热煮沸20min（在煮沸过程中，如紫红色消褪，应即时补中高锰酸溶液，使溶液保持紫红色），然后沿壁加入3mL95%的乙醇，摇匀，趁热过滤，滤液置于100mL容量瓶中，并用少量热水洗涤三角瓶和滤纸34次，洗涤液并入容量瓶中，此滤液即为试样溶液，备用。

2.标准曲线绘制

吸取铬标准溶液0、5.00、10.00、20.00、25.00、30.00mL，分别置于100mL容量瓶中，加入适量水稀释，依次加入4mL1:6硫酸溶液，再加入2.0mL二苯卡巴肼溶液，用水稀释至刻度，摇匀，静置30min，以空白溶液作为参比，用10mm比色皿，在波长540nm处用分光光度计测量其吸光度，以吸光度为纵坐标，铬标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

3.试样测定

在装有试样溶液的100mL容量瓶中，依次加入4mL1:6硫酸溶液和2.0mL二苯卡巴肼溶液，用水稀释至刻度，摇匀，静置30min，按6.2步骤测定其吸光度，求得试样溶液铬的浓度。

4．测定结果

计算公式：

式中：X——试样中铬的含量，mg/kg；

      c——测定用试样溶液中铬的浓度，μg/mL；

      m——试样质量，g。

结果表示

每个试样取2个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。结果表示到0.01mg/kg。

（五）教学方法

讲解、示范和巡回指导。

（六）考核要求

掌握饲料中铬测定的原理及方法

（七）实验报告要求

实验原理、实验步骤、实验结果分析

课程负责人：动物科学技术学院，高凤仙

二零零八年一月