1．实验课程号：

2．课程属性：选修

3．实验属性：非独立设课

4．学时学分：18学时

5．实验应开学期：春季

6．先修课程：分子生物学

一、课程的性质与任务

    分子生物学技术是兽医专业食品卫生检验方向的一门重要选修课。分子生物学技术实验是分子生物学技术重要教学环节之一。通过实验，一方面使学生进一步加深对分子生物学技术基本理论的理解，巩固所学的理论知识；另一方面，让学生了解分子生物学技术的一些研究方法，培养学生的实践操作能力，提高学生分析、解决问题的能力，为学好分子生物学技术及相关课程发挥相辅相成的作用。

二、实验的目的与基本要求

    分子生物学技术实验综合性强，涉及面广，基本操作全面，教学中应达到以下基本目的和要求：

    1．能通运用所学知识，切实领会实验原理；

    2．掌握基本的实验方法和技能，熟练操作步骤，提高学生的实践操作能力；

    3．训练学生独立观察、思考的习惯，能正确预测、分析实验中可能出现的结果，培养学生科学的思维方法和创新能力；

    4．严格要求学生，认真对待实验，精心知识，独立进行实验操作，独立完成实验报告，使学生逐步养成严谨的学风，认真细致的工作态度，为以后的科学技术工作奠定基础。

三、实验考核方式及办法

    (一)总则：实验课考核成绩占该门课程的40％，若实验课考核成绩达不到60分，则不能参加该门课程的期终考试。

    (二)考核内容及成绩计分方法

    1．课堂表现(40分)

    ① 考勤：迟到或早退每次扣5分，旷课一次扣l0分并交学工组老师处理。

②课堂纪律：参照实验守则，违反纪律每次扣10分并交学工组老师处理。

    ③卫生：课堂乱涂画者，每次扣10分，并清除之，课后卫生不符要求擅自离去者，每人每次扣5分。    

  2．实验报告成绩(60分)

     实验报告应独立、按时完成，缺交一次扣10分，抄袭他人作业及被抄袭者一律记0分。

四、实验项目一览表

分子生物学技术课程实验项目一览表

序号	实验名称	实验类型	实验要求	适用 专业	学时
1	分子生物学常用仪器的使用和保养	综合	选修	食品卫生检验	4
2	动物组织中总DNA的提取与纯度鉴定	综合	选修	食品卫生检验	4
3	PCR扩增	综合	选修	食品卫生检验	4
4	实验四   DNA的凝胶电泳	综合	选修	食品卫生检验	6

五、实验项目的内容

实验一   分子生物学常用仪器的使用方法与保养

1．本次实验的目的和要求

（1）熟悉和掌握分子生物学常用仪器的使用方法。

（2）了解和掌握分子生物学常用字仪器的保养方法。

2．实验内容

    （1）分子生物学常用仪器的使用方法

（2）分子生物学常用仪器的保养方法 

（3）分子生物学常用仪器使用时的注意事项

3．需要的仪器 

    （1）PCR扩增仪

（2）冷冻离心机

（3）紫外分光光度计

    （4）凝胶成像系统

（5）超低温冰箱

（6）低温摇床

4．实验步骤

    （1）先听老师讲解各仪器的使用方法、保养和注意事项。

    （2）操作使用。

5．教学方式

    教师讲解，学生独立操作 。

6．考核要求

    掌握常用仪器的使用方法、保养及其注意事项    

7．实验报告要求

    （1）了解实验目的和要求。

    （2）写出常用仪器的使用方法和注意事项。

     

实验二   动物组织中总DNA的提取与纯度鉴定

1．本次实验的目的和要求

学习动物DNA的提取方法和原理，以及DNA纯度的鉴定技术。

2．实验原理

在DNA的提取过程中，利用去污剂如SDS（十二烷基硫酸钠）使组织细胞裂解，并破坏蛋白质的二级、三级结构；利用蛋白酶个水解蛋白质；变性的蛋白质及多糖，脂类等杂质通过有机溶剂如苯酚/氯仿抽提而去除；再用氯仿抽提去除多余的酚；然后向含DNA的上清液加无水乙醇使DNA分子发生凝聚（脱水），最后通过离心得到DNA沉淀。

3．需要的仪器和试剂

（1）仪器

高速离心机、离心管、微加热系统、移液枪、紫外分光光度计。

（2）试剂              

DNA提取液，饱和苯酚，氯仿：异戊醇混合液，无水乙醇，蛋白酶，TE 。              

4.实验步骤

（1）动物DNA的提取

①取猪耳或其它组织器官约1.5g，洗干净，切碎，移至1.5ml离心管中。

②加入DNA提取液0.5ml

③加入蛋白酶K 15ml（蛋白酶K的浓度为10mg/ml），并充分混匀

④放于45℃摇床消化，转速120 rmp，以完全消化为准。

⑤加入等体积饱和酚，充分摇匀，10000 rmp离心5分钟，取上清液。

⑥加入等体积氯仿/异戊醇混合液，充分混匀，10000 rmp离心5分钟，取上清液。

⑦加入2倍体积冰冷的无水乙醇，轻轻混匀，7000 rmp离心2分钟，弃去上清液。

⑧加入适量TE溶解。

（2）DNA纯度及含量测定

5．教学方式

     教师讲解，在老师的指导下，学生动手操作。

6．考核要求

   （1）掌握动物DNA的提取方法。

   （2）掌握DNA的浓度测定和质量检测方法

7．实验报告要求

    （1）掌握实验的原理和操作步骤

    （2）对实验结果进行详细分析

               实验三     PCR扩增

1．本次实验的目的和要求

 通过本实验的学习，使学生掌握PCR反应的基本原理和操作技术。

2.实验原理

聚合酶链式反应（PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量模板DNA、引物、dNTP、耐热DNA聚合酶（Taq酶）和Mg2+等存在的情况下，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA可扩增2n倍，其扩增倍数可用以下公式表示：

Y=（1+X）n

Y：DNA扩增倍数 ,    X：扩增效率，   n：循环次数。

3.需要的仪器及试剂

（1）仪器

PCR热循环仪、台式冷冻离心机、离心管、 移液枪和吸头。

（2）试剂

Taq DNA聚合酶，10×buffer（PCR缓冲液，dNTPs，石蜡油，MgCl2

4.实验步骤

（1）PCR反应体系（25ul）:以猪的氟烷基因的扩增为例。

反应物                体积（ul）              母液浓度

①ddH2O                17.55

②10×buffer           2.5

③dNTPs                0.2                      2mM

④引物1                0.8                      5uM

⑤引物2                0.8                      5uM

⑥MgCl2                 1.5                      25mM

⑦Taq聚合酶            0.25                     5u/ul

⑧DNA模板              0.5                      100ng/ul

（2）PCR反应程序

①94℃预变性:  4分钟

②94℃变性 :   1分钟  

③64℃退火 :   1分钟         循环35次

④72℃延伸 :   1分钟

⑤72℃后延伸:  8分钟

⑥结束

5．教学方式

    教师采用多媒体讲解，学生再动手操作。

6．考核要求

    （1） 掌握PCR反应的原理

     （2）掌握PCR反应程序的编写

7．实验报告要求

    （1）按要求撰写实验报告

    （2）分析实验结果

 

实验四   DNA的凝胶电泳

1.本次实验的目的和要求

学习和掌握DNA的凝胶电泳方法。

2.实验原理

带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。DNA等生物大分子在一定的PH值条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中向相反电移动。

琼脂糖和聚丙烯酰胺作为支持介质的凝胶电泳应用最多，它们是分离，鉴定和纯化DNA和RNA片段的主要方法。琼脂糖比聚丙烯酰胺的分辩率低，但其分离范围广，约200bp～50kb的DNA通常在垂直水平装置上进行，聚丙烯酰胺分离小片段（5～500bp）的效果较好，一般在垂直装置上进行。

3.需要的仪器及试剂

（1）仪器

移液器，电泳仪，电泳槽，凝胶成像系统

（2）试剂 

琼脂糖，50×TAE，溴化乙锭， 上样液

4.实验步骤

（1）用适明透胶将洗净，干燥的电泳凝胶床的两端开口封好。

（2）用电泳缓冲液在微波炉上溶解琼脂糖颗粒，熔化的琼脂糖溶液冷却至60℃时，加入溴化乙锭，其浓度为 0.5ul/ml，充分混匀。

（3）在胶膜放置好梳子后，将温热凝胶倒入胶膜中，倒胶时避免产生气泡，胶厚度为3～5mm.

（4） 凝胶固定后，小心移去梳子和胶带，将凝胶放入电泳槽。

（5）加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶表面1～2mm。

（6） 将样品与上样缓冲液混合。

（7） 用微量移液器将样品加入孔内。

（8）电泳槽通电，在60～100V恒压下电泳。

（9）电泳完成后切断电源，取出凝胶，放于凝胶成像系统下的观察、拍照。

5．教学方式

    教师讲解，并指导学生操作。

6．考核要求

    （1） 掌握琼脂糖凝胶的制作方法

     （2）掌握DNA的凝胶电泳方法

7．实验报告要求

    （1）根据所学知识分析实验结果

    （2）总结归纳本实验的注意事项

六、实验教材及主要参考资料

1．姜泊，张亚历，周殿元，分子生物学常用实验方法。人民军医出版社，1996。

2．熊远著主编，猪生化及分子遗传实验导论。中国农业出版社，1999。

 

七、教改说明及其他

     

    分子生物学技术实验共18学时，为了培养学生独立操作、提高综合分析问题的能力，我们将4个独立实验设计成一个综合性实验：先了解仪器的使用，再提取动物的DNA，然后再对DNA样品进行PCR扩增，最后进行电泳检测，这样既节省人力、物力，又使实验之间增加了连贯性。

主撰人：黄生强

审核人： 

分管教学院长： 

2007年3月20日