高效液相色谱实验室的良好规范(GLP)

1 溶剂的准备

正确准备溶剂对于高效液相色谱(HPLC)试验是非常重要的，它能有效地避免鬼峰、降低基线噪声，从而提高分析能力。

1．1 溶剂质量

HPLC试验均应使用高纯度的溶剂，HPLC级纯度的溶剂比分析级(AR)溶剂的纯度更高，所以稍贵一些。但是使用

HPLC级溶剂一般不会产生鬼峰，而使用AR级溶剂可能会由于杂质的存在导致出现鬼峰。

要保证配制流动相用水的纯度足够高。因为去离子水通常含一些有机化合物，因此不推荐用于HPLC分析。常用的超纯

水(18 Mn ·cm)是去离子水通过离子交换处理得到，现代的水净化装置可以大量生产这种纯水，HPLC级纯水也可以从溶剂

经销商处购买。

注意：不要把HPLC纯水放在塑料瓶中，因为塑料中的添加剂可能会进入到水中造成污染 最好用玻璃瓶储存超纯水

1．2 缓冲溶液

缓冲溶液的储存应有一定的时问限制，药典或相关资料对此都有要求。所有的缓冲溶液都应现用现配，以确保 会 为

缓冲溶液储存时间过长而使流动相pH发生变化，同时也可避免生长微生物 pH的变化和微生物的生长都有可能影响色谱

分离的效果。

商品缓冲溶液中可能包含硫代硫酸钠等稳定剂，这些稳定剂的存在可能会影响缓冲溶液的光学和色谱性能，因此，比较

理想的是购买不含稳定剂的溶剂。注意：重复使用的容器很容易被污染，因此推荐用小容量容器装溶剂

1．3 过滤

理想情况下，所有溶剂都要通过0．45 m 滤膜过滤后再使用，这样能够有效防止由于微粒存在导致流路管线堵塞、过滤

后应把溶剂放在密封容器中，以防止被重新污染。过滤后的溶剂既可用于色谱分析，也可用于清洗诸如泵头、柱塞朴、单向

和密封圈等仪器部件，最大程度地清洗好这些部件能保证系统性能良好。

1．4 脱气

在流动相进入HPLC系统之前应首先脱气。没有脱气的流动相进入到高压系统产生的气泡会导致系统不稳、出现鬼峰等

问题。从溶液中排除气泡的方法主要有：氦气脱气、超声波脱气和真空脱气。氦气或其他低溶解度气体足脱气的有效方法；

在线连续脱气可以防止空气重新溶解在溶剂中。

注意：确保溶剂瓶上有孑L，与大气相通，以防止溶剂瓶内部产生负压

2 溶剂的使用

2．1 仪器

所有流路上都应装过滤器，以防止微粒进入系统。仪器不使用时，应把过滤器浸入到50％ 乙腈水溶液中，以防止微生物

的生长和污染物进入到过滤器中。

流路管线应清洁通畅，且不存在硬性弯曲部分。

储液瓶应尽可能与仪器处于相同高度，且应高于泵的入口。流路管线应长度合适，保证在线过滤器达到储液瓶底部。

注意：在做分析试验之前，应计算好总共需要多少流动相，以便配制足够的流动相并装在合适的容器中。流动相不足会

造成系统抽干并充满空气。如果该类情况发生，需要用新配制的流动相重新冲洗系统并使基线平稳。

2．2 流动相特性

除非HPLC系统和色谱柱能够耐受，一般不要使用强酸或强碱溶液。因为pH过商或过低可能会损害密封圈和柱塞杆。

如有疑问，使用之前最好与色谱柱或仪器经销商联系，了解清楚相关事项。

水含量较高的流动相中容易生长微生物，因此这类流动相比纯有机溶剂流动相更易出现问题。同时还应注意使用水含

量较高的流动相时色谱柱使用方面的限制，因为传统的烷基键合固定相在流动相中有机溶剂的含量低于5％ 以下时容易发生

碳链断裂。一些新型键合固定相可以在以纯水为流动相的条件下使用。

为了避免使用含水流动相时系统中可能生成微生物，建议每隔48 h左右用纯有机溶剂冲洗HPLC系统和色谱柱，以清除

所生长的微生物。此外，加入少量叠氮钠也是抑制纯水相中微生物生长的有效方法，但是要注意它的剧毒性。

注意：不要长时间(例如整个假期)将色谱柱和HPLC系统充满水或缓冲液，要经常用至少含20％ 的有机溶剂冲洗系统。

3．1 缓冲溶液与冲洗／储存溶剂

确保缓冲溶液与冲洗／储存溶剂互溶。如果不能互溶，首先要用水含量相对较高的溶剂冲洗系统和色谱柱，然后再用冲

洗／储存溶剂替换。

3．2 正相和反相

在有些情况下需要使用替换溶剂，比如Hypercarb色谱柱需要采用两种溶剂条件，或者系统需要在正相和反相条件下使

用。如有可能，最好区分开正相和反相分离系统。

要将正相系统转为反相系统或色谱柱的正相条件转变为反相条件，需要用一种与常用正相溶剂和反相溶剂均互溶的中

间溶剂置换。反相系统中含有缓冲溶液时，要用50％ 的甲醇水溶液替换100％ 的甲醇进行冲洗。例如：正相时使用的溶剂为

正己烷／乙酸乙酯，就要先用异丙醇然后用甲醇，最后用50％ 的甲醇水溶液冲洗，然后转为使用甲醇一缓冲溶液，使系统由正相

转为反相。

有些色谱柱既能做正相色谱，又能做反相色谱，因此在使用和改变溶剂之前，一定要检查色谱柱和流动相是否匹配。

如果欲将系统由反相变成正相，则与由正相变成反相的思路相似，但是溶剂顺序相反。例如：反相时使用的溶剂为甲醇一

缓冲溶液，要先用50％ 甲醇水溶液，然后用纯甲醇，最后用异丙醇冲洗，然后转为使用正己烷／乙酸乙酯冲洗，使系统由反相转

为正相。

选择替换溶剂时，请参阅溶剂的相溶性等特性数据资料。

3．3 概述

在尝试替换溶剂时，应确保系统和色谱柱中的溶剂与新溶剂互溶。如果两种溶剂互溶性和物理性质未知，可以把两种溶

剂倒在烧杯中观察，以避免直接进入HPLC系统可能出现不互溶问题。

4 系统管路和连接

理想的HPLC系统应死体积最小、不漏液。

系统管路存在问题会表现在很多方面，如：谱峰区带变宽、基线噪声增加等。由于在系统安装完成之后再检查管路内径

非常困难，因此推荐所有维护过程都应该以相应格式详细记录下来，这样追溯最近的维护与更改细节就比较容易。 ． -

HPLC系统中管路内径会因位置不同而不同，因此应该参考系统维护手册选择符合要求的连接管。大部分HPLC供应商

的连接管可以从标记色环来区分其内径；连接管材料类型可以根据使用范围确定，选择连接管一定要确定管路材料与溶剂是

否匹配，不锈钢和PEEK是最常用的两种材料。

4．I 连接管的裁切

管路的切割应该符合仪器的设计与组装要求。不要用剪刀或剪钳切割HPLC连接管，因为它们会导致管口变形，并形成

锐角切口，这是液体泄露和死体积增加的最主要原因。注意：如有可能，最好用从厂商处购买的预切割好的连接管。

4．1．1 不锈钢管的切割

不锈钢管可按照下述步骤进行切割：① 预先确定所需长度。如果管路需弯折，在弯曲成角度时，要留有一定长度，弯曲角

度太小会使管道内径变形，阻碍溶剂流通。② 使用不锈钢管切管器时，切割后要把管口的毛刺去掉。如果没有切管器，要使

用锉刀处理管口。要尽可能仔细，无论采用何种方法，一定要避免连接管变形或损伤。③ 用两把钳口光滑的钳子，一把位于

切痕上方，另一把位于切痕下方，轻轻地前后弯曲连接管直至将连接管卡断。应避免弯折过猛损伤连接管使断面不齐。④ 在

切割面上可能会有一些毛刺，应小心锉去以获得光滑平整的断面。小心不要让锉下的粉状物质堵塞管口。

4、1．2 PEEK等聚合物材料连接管的切割

切割聚合物管最简单的方法是使用剃刀或者工艺刀片。许多厂家供应聚合物管切管器，使用切管器的最大优点是能保

证刀片与连接管成90。，确保得到平整的切口。

按照以下步骤可以有效地切割聚合物连接管：① 同上不锈钢管的切割步骤① 。② 使用锋利的刀片或特制切管器。不要

用“锯”的动作，这样会使切面不光滑，保证一次动作完成切割。③ 同上不锈钢管的切割步骤④ 。

最后，在将连接管连接到HPLC系统之前，要用溶剂冲洗管路以除去管口和管路中的锉刀屑、灰尘或其他微粒，然后再连

接接头。

4．2 连接接头

制作连接接头的材料主要有不锈钢和各种聚合物材

料，一般情况下不锈钢管用不锈钢连接接头，PEEK管用

PEEK接头。最好不要混合使用不同厂家的接头和刃

环，因为它们的尺寸可能不同，混用容易导致漏液、损坏

螺纹、破坏色谱柱进出口及检测器进液口螺母等问题的

发生。不同厂家的连接管伸入刃环的长度也可能不同，

连接管在螺母中没有良好的密封会导致漏液、死体积增

加等。表1列出了一些品牌连接管的规格。 包括刃环及管头的长度

注意：拧紧接头的时候一定要仔细，过紧可能会破坏螺纹、刃环等而引起漏液，最糟糕的是可能会使接头

断在螺母内。推荐用手拧接头，不仅简单方便，而且可以避免此类问题。很多实验室有不同厂家生产的液相

色谱仪，因此应选择适合与所有仪器连接的通用柱接头。

4．3 SLIPFREE 接头

Hypersil公司设计的SLIPFREE接头可以很方便地调节接头的长度，用手将其拧紧即可耐压到68．95

MPa(10 000 psi)，适合于任何高效液相色谱系统，可用于进样器与色谱柱、保护柱与色谱柱或色谱柱与检测

器之J旬的连接。

当需要较长的连接管时，可以先调节SLIPFREE接头的刃环，然后再固定，使之达到最佳密封。锁紧螺

丝可使SLIPFREE管伸入接头中，从而保证接头以零死体积密封。如果需要了解该产品的更多信息，请与

大连依利特分析仪器有限公司联系。

4．4 管路的堵塞

管路堵塞会导致系统压力升高、柱效降低或从旧接头漏液，此时需要更换管路或清除堵塞物。如果管路

不需要更换的话，可通过以下步骤清除堵塞物：① 将连接管取下，调换方向后直接与泵相连，利用仪器反冲清

除堵塞物。② 用适当溶剂以约0．5 mL／min的流速冲洗管路以清除堵塞物，如堵塞物未知，可用50％ 甲醇水

溶液冲洗；如果堵塞物是不溶于流动相的密封圈碎片等时，上述冲洗过程不能将其清除，可将流速增加到3

～ 5 mL／min，将堵塞物强行冲出(这是最后的选择)。如果堵塞物是溶剂中的杂质，那么这样做比较危险。

为安全起见，使用这种方法时应保证废液管末端放置在封闭的烧杯或密封的废液瓶中。③ 如果管路仍然堵

塞，则必须更换新的连接管。

4．5 旧接头和漏液接头的更换

高压或手拧接头都有一定的使用寿命，到期必须更换。

旧接头的更换：旧接头的不锈钢刃环可能卡在连接管上很难取下来，或者虽然可以取下来但会在连接管

卡口周围留下压痕，这样的连接管不能再次密封，必须切掉。

高压接头的更换：① 关闭所有的泵，使整个系统中没有溶剂流动。② 从连接螺丝上取下接头。③ 在螺丝

和刃环之间将连接管切断，如果不行，在螺丝之前切断连接管。④ 确保切口端平整，没有毛刺。检查旧接头

的螺丝，如果没有坏，则换上新的刃环后就可以重新使用，否则需更换新的螺丝(注意：接头漏液通常是由于

刃环变形引起，所以如果仅仅是刃环损坏则没必要更换螺丝)。⑤ 在连接管上装上新的刃环和接头螺丝并

拧紧，以使螺丝牢牢地卡在连接管上。如果仍然漏液，则需更换连接管。

手拧接头的更换：① 关闭所有的泵，使整个系统中没有溶剂流动。② 从连接螺丝上取下接头。③ 将螺丝

和刃环从连接管上卸下(如果是可以分开的两体式的)。④检查连接管，必要时切去管头部分。⑤ 换上新接

头并将螺丝拧紧。如果仍然漏液，则需更换连接管。

SLIPFREE接头的更换：① 关闭所有泵，使整个系统中没有溶剂流动。② 从连接螺丝上取下接头。③ 检

查刃环是否损坏(这是引起泄漏的最常见原因)。由于SLIPFREE接头的刃环不是卡死在连接管上，相比其

他类型的接头更换更容易。④ 更换新刃环并重新组装，将SLIPFREE接头拧紧。如果仍然漏液，需更换整

个SLIPFREE部分。

注意：如果漏液不是由于接头和刃环本身引起的，那么卸下的接头和刃环可以在其他地方再使用。更换

接头后，如果还漏液，则有必要检查是不是由于接头螺母损坏或堵塞引起的。

4．6 色谱柱的选择

实际应用中，建立分析方法时如果没有指定色谱柱型号，色谱柱选择就非常重要，它可能导致方法分离

效率的差异。在方法建立之初有许多因素需要考虑，如被分析物性质、是否存在发色团等。请向大连依利特

分析仪器有限公司索要相关色谱柱选择指南。

4．7 色谱柱的保护

4．7．1 保护柱／卡套柱

为防止样品或系统中微粒或污染物对色谱柱性能的影响，需要对色谱柱进行保护，通常建议使用保护

柱，这是阻挡微粒对色谱柱损害的经济有效的方法。普通分析柱用10 mm长的保护柱就可有效预防污染。

注意：保护柱是一次性的，如果被污染了，必须更换，不能再生。为保持色谱柱性能，也有色谱专家建议

在进样50至100次后就应更换保护柱。

对于分析柱而言，系统中使用保护柱一般不会降低色谱柱性能。选择保护柱最简单的原则是采用和分

析柱相同种类、相同粒径填料的保护柱。保护柱和分析柱的柱内径越接近越好，这样可以消除溶剂流动和色

谱分离的差异。

Thermo有专用手拧接头保护柱。可以向大连依利特分析仪器有限公司索要保护柱的相关材料。

4．7．2 在线过滤器

在线过滤器一般置于色谱柱入口和溶剂过滤器出口之间，用于除去流路中可能存在的微粒，但它不能阻

挡可溶性杂质。它也是一次性的，需要定期更换。

4．8 色谱柱的使用温度

温度波动会引起色谱峰漂移并产生多种影响。使用色谱柱时，保持柱温恒定非常重要。建议使用柱温

控制单元。理想的柱温控制单元应该能够降温和升温，并且控制温度恒定不受外界环境变化的影响。另外，

有时候分析之前溶剂预热与否对分离的影响也很大。

色谱柱的使用温度在很大程度上还依赖于分析条件和填料类型。典型的石墨化碳基质和聚合物基质填

料可以使用温度要远远高于硅胶基质填料。温度升高会增加溶剂对键合相和硅胶基质化学侵害的程度。例

如在60℃ ，pH 2的缓冲溶液中，键合氨基硅胶填料已经开始水解，这一点从相关的谱图变化可以明显看出。

填料粒度不同也是选择和考虑色谱柱使用温度的因素之一。粒径小于5 m的填料在温度升高时柱床

更容易塌陷，使柱效下降。

如果运用得当，柱温也是改善色谱分离的一个有效方法。降温可以增加保留时间、提高选择性和分离度

等，升温则相反。

4．9 样品的准备

HPLC分析中，样品的准备不仅仅是将固体溶于液体中，还可能包括过滤、萃取、衍生以及准确的称量和

稀释等操作过程。样品中含有悬浮固体杂质时需要过滤，也可以用上面介绍的过滤器在线过滤或过滤到样

品瓶中。注意：使用膜过滤时要确保膜适合使用的所有溶剂。

萃取通常是由于样品中目标化合物含量低，最常用的萃取方法有液一液萃取、固一液萃取法和固相萃取

法。固相萃取法一般是三者中最快、最容易的方法。什么时候选择萃取要由样品决定：(i)当基质，即分析物

中所含的物质容易污染HPLC系统时，或其微粒易于堵塞系统时，需要进行萃取；(ii)被分析物含量低需要

浓缩时。固相萃取操作简单，几乎不需要什么专门设备。若需要更详细的方法、选择合适的吸附剂，请向大

连依利特分析仪器有限公司索取固相萃取方法指南。

样品衍生可在柱前或柱后进行，可以手动也可以自动，一般情况是根据检测目的，例如UV检测不含发

色团的物质。有很多不同的衍生技术，需要仔细选择适合的方法，使方法不能够产生影响后续分离的衍生副

产物。

注意：溶解样品的溶剂与流动相应尽可能互溶，以避免样品通过检测器时引起基线漂移和鬼峰出现。

大连依利特分析仪器有限公司张庆合，李 彤编译