实验课程号：20389B1

1. 课程属性：必修

2. 实验属性：非独立设课

3. 学时学分：总学时50  总学分2.5   实验学时20 实验学分

4. 实验应开学期：春季或秋季

5. 先修课程：动物生理，动物生化，动物营养

一 课程的性质与任务

本实验课是饲料卫生学的重要组成部分，有助于学生把理论知识应用于实践，有助于学生能力的培养。通过饲料卫生学实验课的学习，使学生掌握饲料中有毒有害物质的测定方法，为生产服务。

二 实验的目的与基本要求

通过学习，掌握饲料中有毒有害物质的检测方法。

三 实验考核方法及办法

考查：采用平时操作记分与实验报告记分相结合的考核方式。

四 实验项目一览表

表1  实验内容一览表

实验一  饲料油脂(动植物油脂)新鲜度的测定

第一部分  饲料油脂(动植物油脂)游离脂肪酸、酸价的测定

（一）、实验目的

掌握饲料油脂游离脂肪酸、酸价的检测方法，以判别饲料油脂的新鲜度。

（二）、方法原理

将油料中的油提取后，用碱滴定抽样中的游离脂肪酸。

（三）、仪器设备

分析天平：感量为0.0001g;

碱式滴定管:10ml。

（四）实验步骤

称取试样注入锥形瓶中,加入中和的混合溶剂100ml,加入酚酞指示剂0.5ml/L氢氧化钾溶液滴定至粉红色(持续30s)。

表2  试样取样量

结果计算

式中:V—所用标准氢氧化钾溶液的体积，ml；

c—所用标准氢氧化钾溶液的浓度，mol/L；

56.1—氢氧化钾摩尔质量，g/mol；

n—试样的质量，g。

游离脂肪酸

式中:V—所用标准氢氧化钾溶液的体积，ml；

c—所用标准氢氧化钾溶液的浓度，mol/L；

282—油酸的摩尔质量（如用其他酸表示可用相应数值），g/mol；

n—试样的质量，g。

取两次测量结果的算术平均值作为测定结果。

允许差

游离脂肪酸平行试验允许差不超过0.1%。

酸价平行试验允许差不超过0.2。

实验二  饲料中霉菌检验方法

（一）、实验的目的和要求

学会饲料中霉菌的测定方法。

（二）、实验内容或原理

根据霉菌生理特性，选择适宜于霉菌生长而不适宜于细菌生长的培养基，采用平皿计数方法，测定霉菌数。3、需用的试剂等

（三）、设备及材料

天平：感冒1g，最大秤量1000g。

显微镜：1500×

温箱：25~28±1℃。

冰箱：普通冰箱。

高压灭菌器：2.5kg。

干燥箱：50~250±1℃。

水浴锅：45~77±1℃

振荡器：往复式。

微型混合器：2900r/min。

电炉。

酒精灯

 接种棒：镍铬丝。

温度计：100+1℃

载玻片。

盖玻片。

乳钵。

试管架。

玻璃三角瓶：250,500mL。

试管：15×150mm。

平皿：直径9cm。

吸管：1,10mL。

玻珠：直径5mm。

广口瓶：100,500mL

金属勺、刀等。

橡皮乳头。

（四）实验步骤

霉菌检验程序如下：

（五）、教学方法

讲解、示范和巡回指导。

（六）、考核要求

     掌握饲料中霉菌测定的原理及方法

 （七）、实验报告要求

实验原理、实验步骤、实验结果分析

实验三 饲料中亚硝酸盐的测定

（一）实验目的

学习和掌握饲料中亚硝酸盐的测定方法。

（二）实验原理

样品在微碱性条件下除去蛋白质，在酸性条件下试样中的亚硝酸盐与对氨基苯磺酸反应，生成重氮化合物，再与N-1-蔡乙二胺盐酸盐偶合形成红色物质，进行比色测定。

（三）试剂与仪器

本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。

四硼酸钠饱和溶液：称取25 g四硼酸钠(Na2B4O7•l0H2O，GB632)，溶于500 mL温水中，冷却后备用。

10.6%亚铁氰化钾溶液：称取53g亚铁氰化钾〔K4Fe(CN)6•3H2O，GB1273)，溶于水，加水稀释至500mL。

22%乙酸锌溶液:称取110g乙酸锌〔Zn(CH3COO)2•2H2O，HG3-1098)，溶于适量水和15mL冰乙酸(GB676)中，加水稀释至500mL。

0.5%对氨基苯磺酸溶液：称取0.5g对氨基苯磺酸(NH2C6H4SO3H•H2O，HG3-992)，溶于10%盐酸中，边加边搅，再加10%盐酸稀释至100mL，贮于暗棕色试剂瓶中，密闭保存，一周内有效。

0.1%N-1-奈乙二胺盐酸盐溶液：称取0.1gN-1-萘乙二胺盐酸(C10H7NHCH2NH2•2HCI)，用少量水研磨溶解，加水稀释至100mL，贮于暗棕色试剂瓶中密闭保存，一周内有效。

5mol/L盐酸溶液：量取445mL盐酸(GB622)，加水稀释至1000mI。

亚硝酸钠标准贮备液：称取经115士5℃烘至恒重的亚硝酸钠(GB633)0.3000g，用水溶解，移入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于400ug亚硝酸根离子。

亚硝酸钠标准工作液：吸取5.00mL亚硝酸钠标准贮备液，置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于10ug亚硝酸根离子。

仪器

分光光度计，比色管等。

（四）操作步骤

试液制备

称取约5g试样，精确到0.001g，置于200mL烧杯中，加约70mL温水(60士5℃)和5ml四硼酸钠饱和溶液，在水浴上加热15min(85±50℃)，取出，稍凉，依次加入2mL10.6% 亚铁氰化钾溶液，2mL22%乙酸锌溶液，每一步须充分搅拌，将烧杯内溶液全部转移至200ml容量瓶)中，用水洗涤烧杯数次，并入容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，静置澄清，用滤纸过滤，滤液为试液备用。

标准曲线绘制

吸取0、0.25，0.50，1.00，2.00，3.00mL亚硝酸钠标准工作液，分别置于50mL棕色容量瓶中，加水约30mL，依次加入2mL0.5%对氨基苯磺酸溶液，2mL盐酸溶液，混匀，在闭光处放置3~5min，加入2mL0.1%N-1-蔡乙二胺盐酸盐溶液，加水稀释至刻度，混匀，在闭光处放置15min，以0mL亚硝酸钠标准工作液为参比，用10mm比色池，在波长538 nm处，用分光光度计(4-1)测其他各溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，各溶液中所含亚硝酸根离子质量为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。

测定

准确吸取试液约30m L,置于50mL棕色容量瓶(4-5)中，从“依次加入2ml，0.5%对氨基苯磺酸溶液(3.4),2 mL盐酸溶液”起，按标准曲线测定的方法显色和测量试液的吸光度。

结果计算

计算公式

X=m1×200/(V×m)×1.5=m1/(V×m)×300

式中：X—试样中亚硝酸盐(以亚硝酸钠计)含量，mg/kg；

V—试样测定时吸取试液的体积，mL；

m1-VmL试液中所含亚硝酸根离子质量，ug(由标准曲线读得或由回归方程求出)；

m—试样质量，g；

1.5—亚硝酸钠质量和亚硝酸根离子质量的比值。

结果表示 

每个试样取2个平行样进行测定，以其算术平均值为结果，表示到1mg/kg。

重复性

同一分析者对同一试样同时或快速连续地进行两次测定，所得结果之间的差值；

在亚硝酸盐含量小于或等于1mg/kg时，不得超过平均值的50%；

在亚硝酸盐含量大于1mg/kg时，不得超过平均值的20%。

（五）、教学方式

讲解、示范和巡回指导。

（六）、考核要求

掌握饲料中亚硝酸钠的测定方法。

（七）、实验报告

测定步骤与实验测定结果。

实验四  饲料中铬的测定方法

（一）、实验的目的和要求

学会饲料中铬的测定方法。

（二）、实验内容或原理

以干灰化法分解样品，在碱性条件下用高锰酸钾将灰分溶液中铬离子氧化为六价铬离子，再将溶液调至酸性，使六价铬离子与二苯卡巴肼生成玫瑰红色铬合物，进行比色测定，求得铬的含量。

（三）实验设备

分析天平。

高温电炉（马福炉）。

实验用样品粉碎机或研钵。

电炉：600W。

容量瓶：50、100、1000mL。

吸量管：1、5、10mL。

移液管：5、10、15、20、25、30mL。

三角烧瓶：150mL。

短颈漏斗：直径6cm。

瓷坩埚：60mL。

滤纸：11cm，定性，快速。

分光光度计：有10mm比色皿，可在540nm处测量吸光度。

（四）、实验步骤

1.试样处理

    称取1.0~1.5g样品，精确到0.001g，置于60mL瓷坩埚中，在电炉上炭化完全后，置于马福炉内，由室温开始，徐徐升温，至600℃灼烧5h，直至样品呈白色或灰白色无碳粒为止。

    取出冷却，加入5mL0.5mol/L硫酸溶液，在电炉上微沸，内容物全部移入150mL三角瓶中，并用热水反复洗涤坩埚3~4次，洗涤液并入三角瓶中，加入1.5mL4mol/L氢氧化钠溶液，再加入2滴2%高锰酸钾溶液，加水使瓶内溶液总体积为60~70mL，摇匀，溶液呈紫红色，在电炉上加热煮沸20min（在煮沸过程中，如紫红色消褪，应即时补中高锰酸溶液，使溶液保持紫红色），然后沿壁加入3mL95%的乙醇，摇匀，趁热过滤，滤液置于100mL容量瓶中，并用少量热水洗涤三角瓶和滤纸34次，洗涤液并入容量瓶中，此滤液即为试样溶液，备用。

2.标准曲线绘制

    吸取铬标准溶液0、5.00、10.00、20.00、25.00、30.00mL，分别置于100mL容量瓶中，加入适量水稀释，依次加入4mL1:6硫酸溶液，再加入2.0mL二苯卡巴肼溶液，用水稀释至刻度，摇匀，静置30min，以空白溶液作为参比，用10mm比色皿，在波长540nm处用分光光度计测量其吸光度，以吸光度为纵坐标，铬标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

3.试样测定

    在装有试样溶液的100mL容量瓶中，依次加入4mL1:6硫酸溶液和2.0mL二苯卡巴肼溶液，用水稀释至刻度，摇匀，静置30min，按6.2步骤测定其吸光度，求得试样溶液铬的浓度。。

4．测定结果

计算公式

式中：X——试样中铬的含量，mg/kg；

      c——测定用试样溶液中铬的浓度，μg/mL。

      m——试样质量，g。

结果表示

    每个试样取2个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。结果表示到0.01mg/kg。

结果表示

（五）教学方法

讲解、示范和巡回指导。

（六）考核要求

     掌握饲料中铬测定的原理及方法

（七）实验报告要求

实验原理、实验步骤、实验结果分析

实验五  菜籽饼/粕中硫氰酸酯的测定

（一）、实验的目的和要求

掌握菜籽粕(RSM)及一般菜籽(RS)中的异硫氰酸酯的测定。

（二）、实验内容或原理

菜籽粕中的硫葡萄糖甙，在芥子酶的作用下生成相应的异硫氰酸酯，用二氯甲烷(或氯仿)提取后再用紫外分光光度计测定。

（三）实验设备与试剂

1仪器

紫外分光光度计(有10 mm石英比色皿)、恒温水浴锅，实验振荡器(振荡频率100 次/min)、可调定量加液器(50～250 μL)。

2试剂与溶液

二氯甲烷或氯仿、丙酮、氨水、无水乙醇。

　　pH 7.0缓冲液：0.96 g的柠檬酸溶于蒸馏水并稀释定容到50 mL的容量瓶中，取出35 mL加入165 mL的磷酸盐液(5.68 g的AR级 Na2HPO4)配成200 mL，测试pH值，调至7.0。
　　芥子酶：磨25 g黄芥籽，用75 mL丙酮与175 mL蒸馏水的混合液萃取1.5 h(可用低磁性搅拌器)，然后混浊液离心过滤或用真空泵抽滤，弃去滤渣，加入330 mL 70 %丙酮溶液，收集粘性的芥子酶沉淀物于丙酮中冷冻储藏，有效期约1周。

（四）、实验步骤

1步骤

精确称取100 mg经磨细的菜籽粕到玻璃瓶中(若测饲料称500 mg)。加入1 mL pH=7.0的缓冲液，溶于大约5 mg芥子酶，准确加入2.5 mL的二氯甲烷或氯仿及一颗玻璃珠。紧闭盖子，于振荡器上振摇2 h后静置直到瓶底的二氯甲烷或氯仿层澄清。转移100 μL二氯甲烷溶液到玻璃瓶中，该玻璃瓶预先准确加入6 mL氨基乙醇(1份浓氨水，加4倍的无水乙醇)，盖上试管后置于50 ℃恒温水浴锅恒温2 h。冷却，调整紫外分光光度计，吸收波长235、245、255 nm，使用100 μL二氯甲烷混在6 mL氨基乙醇的溶液作为空白。
2计算

1）吸收光密度：OD245corr=OD245-0.5×(OD235+OD255)

2）异硫氰酸酯总量(mg/g)：

X= (OD245corr/m)×28.55

　　其中：X：试样中异硫氰酸酯的含量，以每克样品中异硫氰化物质量(mg)表示。OD245corr：试样的吸收光密度。m：试样的质量(g)。28.55：转换因素，吸光度为1时，每升溶液中异硫氰酸酯质量为28.55 mg。

（五）教学方法

讲解、示范和巡回指导。

（六）考核要求

     掌握饲料中铬测定的原理及方法

（七）实验报告要求

实验原理、实验步骤、实验结果分析

                                                    主撰人：高凤仙  张佩华

审核人：

分管教学院长：